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奶粉中三聚氰胺的测定方法

2009-01-19 [2066]

GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺

Spectra-Quad实现三聚氰胺含量在线检测

超液相色谱_电喷雾串联质谱法测定饲料中残留的三聚氰胺

反相液相色谱法测定饲料中三聚氰胺的含量

液相色谱-二极管阵列法测定高蛋白食品中的三聚氰胺

液相色谱法(HPLC)测定饲料中三聚氰胺的含量

液相色谱-四极杆质谱联用测定饲料中三聚氰胺含量

固相萃取与液相色谱联用测定宠物食品中三聚氰胺

液相色谱串联质谱法(LC-MSMS)分析宠物食品中三聚氰胺

液相色谱-串联质谱法测定饲料中三聚氰胺残留

GC-MS法测定动物食品中的三聚氰胺

 

测定方法

  本实验中综合各方法稳定性进行比较,主要介绍以下三种:

  • 固相萃取(SPE)方法
  •  HPLC-UV检测方法
  •  LC-MS检测方法(仅供参考)

检测中所需的仪器与条件

  •    Agilent1100液相色谱仪(美国,Agilent公司);二极管阵列检测器(DAD),检测波长240nm,柱温:40

(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm);缓冲液:10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠;流动相:缓冲溶液:乙腈=8515;流速:1.0mL/min

(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm);流动相:缓冲液:乙腈=8515;缓冲液:10mM柠檬酸,10mM辛烷磺酸钠,调pH3.0;流速:1.0mL/min 

  •   离子交换固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰尔科技有限公司)

        混合型的阳离子交换柱(Cleanert PCX 60mg/3mL)50

  •    台式高速(微量)离心机 TG16-WS/TG16-W (湖南湘仪离心机仪器有限公司)

1)角转子: 12*1.5ml12*10ml  转速≥8000rpm/min,微机控制可定时;常温

2)离心管:10ml.1.5ml(一套) 

  •  三聚氰胺标准品1(250mg,99.5) 
  •    三聚氰胺分析方法手册1份

 

其他试剂

饲料/奶粉样品;甲醇、乙腈;氨水、乙酸铅、三氯乙酸、柠檬酸、庚烷磺酸钠 、辛烷磺酸钠(Sigma公司);甲醇为色谱纯,其他均为化学纯。

理化性质 

三聚氰胺:英文名"melamine",简称三胺,学名三氨三嗪,别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式:C3N6H6C3N3(NH2)3:分子量:126.12

物理性能:白色结晶粉末,无毒,无味;相对密度:1570kg/m3;熔点:在常压下,354分解;升华温度:300;溶解性:能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶;微溶于水、乙醇;不溶于乙醚、苯和四氯化碳、苯和四氯化碳,水溶液呈弱碱性

化学性能:三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料,显弱碱性,能够与各种酸反应生成三聚酸二酰胺盐;在强酸或强碱液中,三聚氰胺发生水解,胺基逐步被羟基取代,处成三聚氰酸二酰胺、三聚握酸一酰胺和三聚氰酸;三聚握胺与醛类反应生成加成化合物;三聚氰胺与甲醛反应制成树脂,三聚氰胺树脂,三聚氰树脂是一种多种用途的材料,防水耐热且有很高的稳定性,用于生产塑料、地板砖,厨房用具,防炎纤维,商业滤膜,胶水和阻燃剂。

 固相萃取(SPE)方法

1 固相萃取(SPE)柱的选择: 

三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物),净化过程一般选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基因(-SO3H)键何在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上,具有阳离子和反相两种吸附机理,并具有以下优点:

1)               可通过两种不同溶液的洗涤(水/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂),使样品更干净,提高检测的灵敏度。

2)               批次重复性好。

3)               回收率高,重现性好,即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

 

 

  PCX结构式

 

2 样品前处理步骤:

2.1 标准样品配制:

     50mg三聚氰胺标准品,以20%甲醇溶解定容至50ml得到1000ppm的标准溶液,使用时,以提取液(1%三氯乙酸)稀释至所要的浓度。

2.2 提取

     称取饲料/奶粉样品5g (或牛奶10ml),加入50ml  1%三氯乙酸提取液,充分混匀,加入2ml 2%乙酸溶液,超声20min。然后取部分溶液转移至10ml离心管中,并将其放置于离心机中,启动离心机使转速达到8000rpm/min 离心 10min后,取上清液3mL 过混合型阳离子交换小柱(PCX)。 

2.3 净化(PCX小柱,60ml/3ml):

   1 活化及平衡: 3ml甲醇 3ml

   2 上样:加入提取液 3ml

   3 淋洗:3ml 水;3ml甲醇:弃去淋洗液并将小柱抽干。

   4 洗脱:5ml  5%氨化甲醇(v/v)洗脱。(5%氨化甲醇的配制:5ml氨水+95ml甲醇)。

  5)  浓缩:50°C,氧气吹干,20%甲醇/水定容至2mlHPLC分析或衍生后GC/MS分析。

 

HPLC-UV检测方法

三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差,需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离,按照美国食品药品监督管理局(FDA)的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法,采用Venusi ASB系列亲水色谱柱,均能得到良好的结果,分析色谱图如下: 

1、 三聚氰胺的FDA检测方法

色谱柱:Venusil ASB C8 4.6×250mm

缓冲液:10mM辛烷磺酸钠,调Ph3.0

流动相:缓冲液:乙腈=8515

进样量:样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL,10uL

  速:1.0Ml/min

  温:40 °C

  长:240nm

 

2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法

色谱柱:Venusil ASB-C8 4.6×250mm

缓冲液:10mM柠檬酸,10mM庚烷磺酸钠

流动相:缓冲溶液:乙腈=8515

进样量:样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL,10uL

  速:1.0Ml/min

  温:40°C

  长:240nm

 

1 PCX柱回收率

添加水平(mg/L)
回收率
空白
 
0.01
116%
0.1
108%
0.5
92%
2
96%
 

由上表1可以看出:用PCX柱净化样品,可以得到满意的回收率,此方法处理样品,比FDA公布的前处理方法更加准确、可靠。

 

LC-MS参考方法   LC-MS方法检测三聚氰胺的谱图 

      由于FDA公布的HPLC-UV方法中,流动相添加了离子对试剂,限制了液质联用方法的使用;但不用离子对试剂色谱方法,三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差,没有良好的保留与分离。 源于此问题采用Venusil ASB系列亲水色谱柱,不用离子对试剂也能得到有效的保留与分离,参考方法如下:

    缓冲液:10mM NH4AC

流动相:缓冲液:ACN=95 5

进样量:先用70%ACN溶解成约1mg/mL,CAN稀释成1.0mg/mL,10uL

 柱  温:40°C

  长:240nm 

FDA20074月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比较,该方法大大降低了zui低检测限(MSD0.5ppmUV2ppm),提高了检测灵敏度。

       以该方法分别在ASB-C84.6×250mmASB-C184.6×250mm得到的谱图如下:

 

结果与讨论

阳离子交换柱(PCX)

    三聚氰胺呈弱碱性(弱阳离子化合物),净化过程一般应选择阳离子交换柱。混合型的阳离子交换柱(PCX)通过将磺酸基团(-SO3H)键合在极性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附剂上,具有阳离子交换和反相吸附两种机理,并具有以下优点:

a)可通过两种不同溶液的洗涤(/一定pH值的缓冲溶液和有机溶剂),使样品更干净,提高检测的灵敏度。

b)批次重复性好。

c)回收率高,重现性好,即使小柱跑干也可以得到较高回收率。

 

      国家食品质量监督检测中心有关人士称,在现有的国家标准奶粉检测中,主要进行蛋白质、脂肪、细菌等检测。三聚氰胺属于化工原料,是不允许添加到食品中的,所以现有标准不会包含相应内容。也就是说,三聚氰胺不属于常规检测项目,正常情况下,很少有人会想到去检测它。

 

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