出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法

中华人民共和国进出口商品检验行业标准 中华人民共和国进出口商品检验行业标准

　　　　 出口禽肉中杆菌肽残留量检验方法
　　　　　　　　　 杯 碟 法 SN 0295?93
Method for the determination of bacitracin
residues in poultry meat for export
?Cylinder-plate method
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1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了出口禽肉中杆菌肽残留量的抽样、制样和杯碟测定法。
　　本标准适用于出口冻鸡中杆菌肽残留量的检验。
2　引用标准
　　SN 0179　出口食品中四环素族抗生素残留量检验方法
3　抽样和制样
3.1　检验批
　　以不超过2500件商品为一检验批。
　　同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。
3.2　抽样数量
　　　　　　　批量,件　　　　　　　　　　　　zui低抽样数,件
　　　　　　　　1～25　　　　　　　　　　　　　　　1
　　　　　　　26～100　　　　　　　　　　　 　　　5
　　　　　　　101～250 　　　　　　　　　　　　 10
　　　　　　　251～500 　　　　　　　　　　　　 15
　　　　　　　501～1000 　　　　　　　　　　　　 17
　　　　　 1001～2500　　　　 　　　　　　　　　20
3.3　抽样方法
　　按3.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启,每件至少取一袋作为原始样品,原始样
品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后,标明标记,及时送交实验室。
3.4　样品制备
　　从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入绞碎机中绞碎均匀,充分
混匀、用四分法缩分不少于1kg试样,装入清洁容器内,加封后,标明标记。
3.5　样品保存
　　将试样于?18℃冷冻保存。
　　注：在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
4　测定方法
4.1　方法提要
　　用33％吡啶溶液提取试样中杆菌肽,将提取液再用甲醇提取,经减压浓缩至干,用磷
酸盐缓冲液溶解残留物,调整pH后用杯碟法测定。
4.2　设备和材料
4.2.1　培养皿：内径90mm,底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿,并应配有陶瓦盖。
4.2.2　牛津杯：外径7.8±0.1mm,内径6.0±0.1mm,高10±0.1mm,不锈钢管。
4.2.3　游标卡尺：测量范围0～200mm,精度0.02mm,或使用抑菌圈测量仪测量。
4.2.4　离心机：转速3000r/min。
4.2.5　旋转式真空浓缩器。
4.2.6　恒温培养箱：36±1℃。
4.2.7　高压灭菌器。
4.2.8　其他：玻璃板,吸管,滴管,茄形瓶等。
4.3　试剂和培养基
4.3.1　试剂
4.3.1.1　吡啶: 分析纯。
4.3.1.2　吡啶溶液：33％。取吡啶33mL,用蒸馏水定容至100mL。
4.3.1.3　甲醇：分析纯。
4.3.1.4　磷酸盐缓冲液:5％, pH6.5。称取22.15g无水磷酸氢二钾和27.85g无水磷酸
二氢钾溶解于蒸馏水中,定容至1000mL。
4.3.1.5　氢氧化钠溶液：1mol/L。
4.3.1.6　磷酸盐缓冲液:1％, pH6.0。称取2.0g无水磷酸氢二钾和8.0g无水磷酸二氢
钾溶解于蒸馏水中,定容至1000 mL。
4.3.1.7　杆菌肽标准品：58 IU/mg(卫生部药品生物制品检定所提供)。
4.3.1.8　试验菌种:藤黄微球菌(Micrococcus Luteus), 菌种号28008(卫生部药品生
物制品检定所提供)。
4.3.2　培养基
4.3.2.1　增菌用培养基: 见附录A第A1章。
4.3.2.2　基层用培养基: 见附录A第A2章。
4.3.2.3　菌种层用培养基: 见附录A第A3章。
4.4　测定步骤
4.4.1 工作液制备
4.4.1.1　杆菌肽标准贮备液
　　准确称取适量的杆菌肽标准品,用1％pH6.0磷酸盐缓冲液配制成100 IU/mL的标准
贮备液,于冰箱中保存,可使用一周。
4.4.1.2　杆菌肽标准工作液
　　吸取一定量杆菌肽标准贮备液,用1％pH6.0磷酸盐缓冲液稀释成0.15和0.6 IU/mL
的工作标准液,以及0.025,0.050,0.100,0.200,0.400,0.800 IU/mL的稀释液,作为制
备标准曲线的标准浓度溶液,0.100 IU/mL的稀释液为参考浓度溶液。以上稀释液均须
当日配制。
4.4.1.3　菌种培养及菌液的制备
　　将试验菌种安瓿瓶上部消毒后敲碎,加入少量增菌用培养基(4.3.2.1)溶解后,移入
以上培养基中,混匀后于36±1℃培养24h,再转接至琼脂试管斜面(4.3.2.3), 培养16～
18h,然后加入适量生理盐水,将菌苔洗下,备用。
4.4.2　试液制备:准确称取经绞碎混匀的试样10.0g于均质器内,加入17mL吡啶溶液(33%),
均质3min后,移入离心管中离心20 min(3000 r/min)。取上清液10mL,置于另一个离心管
内,加入30 mL甲醇充分振摇2min,再离心 20min(3000 r/min)。将上清液移入茄形瓶中,
减压浓缩至干,加入3mL磷酸盐缓冲液(5％)溶解即为样液。此样液中相当于禽肉试样浓度
为1.96g/mL。
4.4.3　测定
4.4.3.1　平板制备
　　于无菌平皿中加入 20mL熔化的基层用培养基(4.3.2.2),保持水平,待其凝固备用。
然后,将锥形瓶中菌种层用培基(4.3.2.3)经熔化并冷却至50～55℃,加入适量的试验菌
液(4.4.1.3)使之充分混合后,取4mL注入上述基层培养基上,保持水平,待其凝固。在测
定前应先用0.15 IU/mL标准工作液对该菌液浓度的平板进行预测试,经培养后其标准工作
液所呈现的抑菌圈直径在10mm以上,则该菌液浓度的平板即可使用,否则须调整其菌液浓
度,制成合于检定用的平板。
4.4.3.2　标准曲线的制备
　　可参照SN 0179?92中的6.1。
4.4.3.3　检测
　　每个样品用三个检定平板,在每个平板上,如不需定量时,置4 只消毒的牛津杯,对
角2只注满样液,剩余的2只杯里分别注满0.6IU/mL和0.15 IU/mL杯菌肽标准工作液;如需
定量时,须置6只消毒的牛津杯,间隔注满样液和0.1 IU/mL杆菌肽标准工作液,于36±1℃
培养17±1 h。
4.5　结果计算和表述
4.5.1　结果计算和表述
　　在三个检定平板上,如样液呈出与0.6IU/mL和0.15IU/mL标准工作液相同的清晰抑
菌圈时,可用游标卡尺或测量仪进行测量,其抑菌圈平均直径在10 mm以上者为阳性。
　　对于需定量的实验结果,将分别算出三个检定平板上0.1 IU/mL和样液的抑菌圈直径
的平均值,经校正后,于标准曲线上查出其抑菌圈直径的平均值所对应的标准浓度值,通
过式(1)计算可得出样品中抗生素的含量:
c
X＝── ......................(1)
m
式中：X??样品中杆菌肽的含量,IU/g;
　　　c??从标准曲线上查出样液所对应的抗生素浓度,IU/mL;
　　　m??zui终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。
4.5.2　结果换算
　　如果样品中杆菌肽含量的单位要采用mg/kg表示时,可将IU/g按照下述方法进行换算:
标准品中杆菌肽含量＝A IU/mg
　　样品中杆菌肽含量＝B IU/g
1 IU＝1/A mg＝1/A×10＊＊3μg .............................(2)

B IU/g＝B/A×10＊＊3μg/g＝B/A×10＊＊3mg/kg .................(3)

式中：A??标准品中杆菌肽含量的数值;
　　　B??依据式(1)计算所得到的样品中杆菌肽的数值。
5　测定低限、回收率
5.1　测定低限
　　本方法测定低限为0.025 IU/g。
5.2　回收率
　回收率的数据:杆菌肽添加浓度在0.025～0.100IU/g范围内,回收率为74.8％～108.8％。

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附　录 A　
　　　　　　　　　　　　　 培养基成分及制备方法
　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)
A1 增菌用培养基
　　　　蛋白胨 10.0g
　　　　牛肉浸膏　　　　　　　 5.0g
　　　　氯化钠　　　　　　　　 2.5g
　　　　蒸馏水 1000mL
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1 mol/L氢氧化钠溶液或10％盐酸调节pH,使
其灭菌后pH为7.0±0.1, 分装于小试管中,每管约3mL,于121℃15min高压灭菌。
A2　基层用培养基
　　　　蛋白胨　　　　　　　　 6.0g
　　　　牛肉浸膏　　　　　　　　 1.5g
　　　　酵母浸膏　　　　　　　 3.0g
　　　　琼脂 15.0g
　　　　蒸馏水 1000mL
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10％盐酸调节pH,使其
灭菌后pH为6.5±0.1,分装于锥形瓶内,于121℃15 min高压灭菌,备用。
A3　菌种层用培养基
　　　　蛋白胨　　　　　　　　 6.0g
　　　　牛肉浸膏　　　　　　　 1.5g
　　　　酵母浸膏　　　　　　　 3.0g
　　　　葡萄糖　　　　　　　　 1.0g
　　　　胰酪蛋白　　　　　　　 4.0g
　　　　琼脂 15.0g
　　　　蒸馏水 1000mL
　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10％盐酸调节pH,使其
灭菌后pH为6.5±0.1,分装于锥形瓶和大试管内,于121℃15min高压灭菌。灭菌后将试管
制备成所需斜面备用。
附 录 B
检验程序图
(补充件)
试样(10.0g)　　　　　　　　　　　标准贮备液　　　　　　　　　　　试验菌培养
┃　　　　　　　　　　　　　　　┃　　　　　　　　　　　　　　　┃
┃ 于均质杯内加入 ┃ ┃
┃ 17 mL33％吡啶 ┃ ┃
┃ ┃ ┃
均质3min ┃ ┃
┃ 移入离心管 ┃ ┃
┃ ┃ ┃
离心20min(3000r/min) 标准工作液　　　　　　　　　　　菌液制备
┃　　　　　　　　　　　　　　　┃ ┃
取上清液(10mL) ┃ ┃
┃ ┃ ┃
┃ 加入30mL甲醇 ┣━━━━━━━━━━━━检定用平板制备
┃ ┃　　　　　　　　　　　　　　　┃
振摇2min ┃ ┃
┃ ┃ ┃
离心20min 制备标准曲线 ┃
┃ ┃
取上清液入茄形瓶 ┃
┃ ┃
蒸 干 ┃
┃ 加入3 mL 5％ ┃
┃　磷酸盐缓冲液 ┃
┃ ┃
样液(pH6.5) ┃
┃ ┃
┗━━━━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━┛
┃
检 测
　　　　　　　　　　　　　　　　　 ┃
结果计算和表述

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附加说明:
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。
本标准等同采用日本厚生省检验方法,畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。
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中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-12-28批准 1994-05-01实施